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本试剂盒适用于从各种酵母样品中提取线粒体蛋白，提取过程简单方便，提取得到的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，下游应用范围广，提取液裂解细胞的能力较温和，需要根据实际样本情况优化裂解时间。

本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。蛋白酶抑制剂中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 试剂拆封后请尽快使用完。

• 仪器准备：离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒。
  
• 试剂准备：PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒。
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液准备：每500μL冷的酵母线粒体蛋白提取液D中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  
• 酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
  
• 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每100～200μL体积或100～200mg湿重酵母沉淀物中加入400μL酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
  
• 在1000×g条件下离心5～10分钟，收集酵母沉淀。
  
• 酵母沉淀物中加入500μL酵母线粒体提取液B，充分混匀后。
  
• 在37℃或室温条件下轻微振荡60～90分钟。
  
• 在2000g条件下离心5～10分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 沉淀用PBS洗涤两次。离心收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入800μL酵母线粒体提取液C，充分混匀，然后在振荡器上振荡15～30分钟。
  
• 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
  
• 将上清在4℃，2000×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
  
• 将上清在4℃，14000×g条件下离心20分钟。弃上清，收集沉淀。
  
• 在沉淀中加入200～300μL线粒体蛋白提取液D，充分混匀。
  
• 在4℃条件下振荡20～30分钟。
  
• 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到酵母线粒体总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

• 蛋白浓度低？
  处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长酵母线粒体提取液B、C及线粒体蛋白提取液D的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为酵母线粒体提取液A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。